<855> 散射光濁(zhuó)度法和透射光比濁(zhuó)法

1.     介紹

散射光濁(zhuó)度法和透射光比濁(zhuó)法是基於光散射現象原理的分析技術。光散射是一種物理現象，其中光束由於與足夠小的物質粒子相互作用而改變其傳播方向（稱爲偏轉）。根據麥克斯韋電磁理論
，散射發生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同於懸浮液體的折射率。差異越大，散射越強烈。光散射有兩種類型：1）彈(dàn)性散射，其中散射光和入射光的波長(zhǎng)相同；2）非彈性光散射，其中散射光和入射光的波長不同
。隻有第一種光散射（彈性）與散射光濁(zhuó)度法和透射光比濁(zhuó)法有關
。

在透射光比濁法中，測(cè)量透射光的強度，並(bìng)在入射光方向（即0°）測量散射導緻的入射光強度的衰減，並(bìng)與入射光強度進行比較（空白測量）。被測特性是懸浮顆粒散射效應的間接測量，稱爲濁度。懸浮樣品對光的任何吸收都會導緻光強度的額外衰減（參(cān)見<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，確(què)保被測(cè)材料不會吸收測(cè)量波長處的光非常重要。實際上，控制吸收和濁度測(cè)定的方程式是相同的（盡管衰減常數的值不同）。在散射光濁度法中，測(cè)量與入射光傳播方向成90°角的散射光強度。因此，散射光濁度法濁度測(cè)量是對(duì)懸浮物散射效應的直接測(cè)量。

2. 術語和定義

描述濁度法和濁度法的常用術(shù)語(yǔ)包括：

•濁度（符号S）：由於(yú)懸浮顆粒的光散射效應，透射入射光束強度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過觀察透射光（比濁法）或散射光（濁度法）來測(cè)量。

log I₀/I_t = kbc = T

I₀=入射光強度

I_t=透射光強度

k=摩爾濁度系數

b=樣品池路徑長度

c=濃度

T=濁度

•濁度（符号，τ）：在透射光濁度測(cè)量中，濁度是給(gěi)定懸浮液的入射光束強度/單位長(zhǎng)度減少的量度。國際标準化組織将濁度定義爲“由於(yú)存在未溶解物質而導緻液體透明度降低"。

•濁度測(cè)量單(dān)位
：渾濁度單(dān)位用一個描述符表示，該描述符指示測(cè)量方法。

•散射光濁度計濁度單位（NTU）：當使用散射光濁度法測(cè)量濁度時，濁度計以與入射光傳(chuán)播方向成90°角的角度測(cè)量散射光，濁度單位稱(chēng)爲散射光濁度法濁度單位（NTU）。NTU的大小是根據初級福爾馬肼标準品（一種将硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液）産(chǎn)生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現已上市，並(bìng)被*爲可接受的替代品。然而，所有這些标準都可以追溯到福爾馬肼。初級福爾馬肼标準溶液的濁度爲4000 NTU。

其他*的濁度單(dān)位包括福爾(ěr)馬肼比濁法單(dān)位（FTU）和福爾馬肼濁度法單位（FNU）。這些單位相當於0-40 NTU範圍内的NTU。

3.     應用

透射光比濁法和散射光濁度法技術(shù)的應(yīng)用包括1）溶液和/或懸浮液的濃度測(cè)定（通過在控制良好的反應參(cān)數下沉澱和懸浮産生的沉澱物，來測(cè)定幾種陽離子和陰離子）；2）測(cè)量混濁溶液或懸(xuán)浮液的濁度；3）測定分子量在1000到數(shù)億之間(jiān)的多分散體系的重均分子量和尺寸；4）測(cè)量免疫分析的反應動力學或免疫沉澱(diàn)動力學（比率散射濁度法）；5）監測細胞和細菌的生長；6）懸浮物粒度分布測(cè)定、顆粒計(jì)數等。

比率散射濁度法廣(guǎng)泛用於(yú)疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用於(yú)重組生物制藥中的宿主細胞蛋白質鑒定。當使用該技術時，通過測(cè)量抗原-抗血清或抗原純(chún)化抗體複合物的光散射反應的變(biàn)化，來計算導緻免疫抗體-抗原沉澱(diàn)反應(yīng)或凝集反應(yīng)的抗原（Ag）或抗體（Ab）的量。通常考慮抗原共價連接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此産(chǎn)生的技術被稱(chēng)爲“顆粒增強免疫分析"。雖然這項技術被稱(chēng)爲散射光濁度法
，但通常散射光和透射光都是用比率儀器測(cè)量的。

散射光法濁度測(cè)量在低濁度範圍（散射介質濃度相對(duì)較低）更可靠。在該範圍内，觀察到樣品濃度與檢測(cè)器信号強度（以NTU表示）之間存在線性關系。随著(zhe)濃度的增加，多次散射的入射角也會增加，從(cóng)而偏離線性響應。支持可靠線性關系的最大NTU值在1750–2000 NTU範圍内。透射光比濁法适用於(yú)更高的濁度範圍（散射介質的濃度）。爲瞭(le)獲得一緻的結果
，必須仔細控制所有測量變量。在可能的情況下，可以測量極稀的懸浮液。

4. 儀器儀表

用於(yú)透射光比濁法和散射光濁度法測(cè)量的儀器分别稱爲透射光濁度計和散射光濁度計。通常，這些儀器包括一個帶有濾光器的汞燈（用於(yú)強綠線或藍線）、一個快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個靈敏的光電倍增管，該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成0°或90°角的位置，或者在一個臂上，它可以圍繞溶液單(dān)元旋轉，並(bìng)通過不透光外殼外的表盤設置爲−135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣，例如用於(yú)測(cè)量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射爲半八角形；圓柱形可适用於(yú)所有角度的散射（見(jiàn)圖1）。

圖1.代表性濁度儀(yí)。注意，探測(cè)器2可安裝在可移動臂上。

濁度也可以用标準光電濾光光度計或分光光度計測量，最好是在光譜的藍色部分進行照明。散射光濁度法測量需要一個裝有光電管的儀器，以便接收散射光，而不是透射光。由於(yú)這與熒光計中使用的幾何結構相同，因此可通過适當選擇濾光片将其用作濁度計。比率濁度計結合瞭(le)90°散射光濁(zhuó)度法和透射光比濁(zhuó)法。它包含光電管，接收和測量與樣品成90°角的散射光
，以及接收和測(cè)量樣品前面的前向散射光。它還測(cè)量直接穿過(guò)樣品的光。通過(guò)90°角散射光測量值，前向散射光測量值和透射光測量值之和，計算兩者的比值，可獲得線性度。使用比率濁度測量系統的好處是雜散光的測量變(biàn)得可以忽略不計
。此外，彩色懸浮液的濁度測定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀（帶比率模式）進行，因爲該程序補償瞭(le)懸浮液顔色導緻的光衰減。通常，這些儀器中的光源是鎢燈，在2700 K的燈(dēng)絲溫度下工作，大部分光強(qiáng)約爲550 nm。也可使用其他合适的光源。通常，探測(cè)器是▲矽二極管▲和光電(diàn)倍增管。另一種消除顔色效應的方法是使用紅外發(fā)光二極管作爲光源，其最大發(fā)射中心約爲860 nm，光譜帶寬爲60 nm。當激光光源也被使用時，尤其是在濁度測(cè)量儀器中，這種技術通常被稱(chēng)爲“激光濁度測量"。使用激光散射光濁度計的優點是，在非常低的檢測(cè)水平下，信噪比顯著提高。通常光源是工作波長(zhǎng)爲660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子産(chǎn)生更高的散射強度。與吸收未散射光的光阱相結合，該系統可顯著降低雜散光。當(dāng)專著中的某個程序指示使用散射光濁度計或透射光濁度計時，可以使用在比率模式下工作的儀器。

5. 福爾馬肼濁度标準

福爾馬肼是目前已知的主要濁度标準。所有其他标準都是次要的，必須追溯到福爾馬肼。 主要标準在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金書）中被定義爲由用戶使用明確(què)定義的方法和條件從可追溯的材料準備(bèi)的标準。

福爾馬肼懸浮液有許多特點，以確(què)保其适合作爲主要标準。它可以從試劑級的起始材料中始終如一、準確(què)地制備。該懸浮液由不同長度和随機構型的聚合物組成，其組成的聚合物的形狀和尺寸從小於(yú)0.1 μm到大於10 μm不等。盡管聚合物鏈長(zhǎng)分布已被證明因制備(bèi)而異，但總的濁度結果是可以很好地重現的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼标準液的制備

•硫酸肼溶液：将1.000 g ACS級硫酸肼（N₂H₄·H₂SO₄）溶解在100 mL 的A類容量瓶中中，並(bìng)用無顆粒水稀釋至刻度。讓該(gāi)溶液靜置4-6小時。

•初級福爾馬肼标準液：将2.50 g分析級六亞甲基四胺[(CH₂)₆N₄]溶於25.0 mL無顆粒水中，裝入100 mL燒瓶。使用A類25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，並(bìng)充分混合。使用前，讓制劑(jì)在25±1°的溫度下靜置48小時(shí)。由此産(chǎn)生的懸浮液可穩定運行2個月。

•福爾馬肼儲備标準懸浮液1：使用15 mL A類移液管，将15 mL福爾馬肼初級标準液轉移至1 L容量瓶中，並(bìng)用無顆(kē)粒水稀釋至刻度並(bìng)混合。所得懸浮液的濁度爲60 NTU。

•福爾馬肼儲備标準懸浮液2：使用50 mL A類移液管，将50 mL福爾馬肼初級标準液轉移至200 mL容量瓶中，並(bìng)用無顆(kē)粒水稀釋至刻度並(bìng)混合。所得懸浮液的濁度爲1000 NTU。

•福爾馬肼參考懸浮液
：根據表1，在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲備(bèi)标準懸浮液和無顆粒水，制備(bèi)福爾馬肼參(cān)考懸浮液。